Zespół 1

Profil badawczy Zespołu

Zespół prowadzi innowacyjne badania nad molekularnymi mechanizmami neuroprotekcji i neurotoksyczności. Prowadzone prace obejmują trzy powiązane tematycznie obszary badawcze, integrujące nowoczesne podejścia z pogranicza neurobiologii, biologii molekularnej i toksykologii. Celem zespołu jest nie tylko pogłębienie wiedzy o patomechanizmach uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego, lecz także identyfikacja potencjalnych celów terapeutycznych i czynników ryzyka istotnych z perspektywy medycyny translacyjnej.

Prowadzone przez Zespół prace obejmują trzy powiązane tematycznie obszary badawcze.

Pierwszy obszar badań dotyczy opracowania innowacyjnych podejść terapeutycznych w leczeniu ostrych uszkodzeń mózgu, takich jak udar niedokrwienny i niedotlenienie okołoporodowe. Strategia ta opiera się na selektywnej modulacji niejądrowych receptorów estrogenowych w celu aktywacji mechanizmów neuroprotekcyjnych.

Drugi kierunek badawczy koncentruje się na ocenie wpływu semaglutydu — agonisty receptora GLP-1 stosowanego w terapii cukrzycy typu 2 i otyłości — na rozwój ośrodkowego układu nerwowego w okresie prenatalnym. Projekt ten ma na celu określenie, w jaki sposób aktywacja szlaku GLP-1R w okresie ciąży wpływa na procesy neurogenezy, tworzenie połączeń synaptycznych oraz funkcje poznawcze u potomstwa, a tym samym identyfikację potencjalnych zagrożeń wynikających z ekspozycji na ten lek we wczesnym okresie rozwoju prenatalnego.

Trzeci obszar badawczy skupia się na wpływie ksenobiotyków, ze szczególnym uwzględnieniem benzofenonu-3 (BP-3) – szeroko stosowanego chemicznego filtra UV, obecnego w kosmetykach oraz innych produktach konsumenckich. Zespół analizuje neurotoksyczne oddziaływanie tej substancji na rozwijający się ośrodkowy układ nerwowy, ze szczególnym naciskiem na konsekwencje prenatalnej ekspozycji. Badania obejmują zarówno osobniki bezpośrednio narażone (pokolenie F0), jak i ich potomstwo (F1) oraz dalsze pokolenia (F2), pozwalając na rozróżnienie efektów wielopokoleniowych (multigenerational effects), wynikających z bezpośredniej ekspozycji kolejnych pokoleń, oraz efektów transgeneracyjnych (transgenerational effects), definiowanych jako dziedziczne zmiany fenotypowe pojawiające się u potomków pozbawionych bezpośredniego kontaktu z czynnikiem toksycznym. W ramach tych badań szczególną uwagę poświęca się mechanizmom epigenetycznym i molekularnym, które mogą leżeć u podstaw trwałych modyfikacji funkcji neurobiologicznych i mają potencjalne implikacje dla zdrowia populacji.

Zespół integruje zaawansowane techniki biologii molekularnej, neurobiologii rozwojowej oraz toksykologii środowiskowej, aby kompleksowo badać mechanizmy leżące u podstaw neuroprotekcji i neurotoksyczności. Dzięki multidyscyplinarnemu podejściu możliwa jest identyfikacja nowych, precyzyjnych celów terapeutycznych oraz lepsze zrozumienie molekularnych i epigenetycznych mechanizmów ryzyka neurotoksycznego. Realizowane badania mają na celu nie tylko pogłębienie wiedzy o patogenezie uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego, lecz również przyczyniają się do rozwoju innowacyjnych strategii leczenia i profilaktyki. Uzyskane wyniki mają potencjał bezpośredniego zastosowania w medycynie translacyjnej, co przyczynia się do opracowania skuteczniejszych terapii oraz minimalizacji negatywnego wpływu czynników środowiskowych na zdrowie mózgu.

Ponadto, prace członków Zespołu dostarczają istotnych informacji dla polityk zdrowotnych i działań z zakresu zdrowia publicznego, mających na celu ochronę najbardziej wrażliwych populacji, w tym kobiet w ciąży oraz rozwijającego się płodu. Prace Zespołu te były wielokrotnie cytowane przez międzynarodowe instytucje i ekspertów, m.in. przez Human Biomonitoring for Europe (program Unii Europejskiej), Food and Drug Administration (FDA), Experts Panel for Cosmetic Ingredient Safety, Organization for Economic Co-operation and Development (OECD), European Chemicals Agency (ECHA), Agencję ds. Bezpieczeństwa Żywności, Środowiska i Pracy Francji (ANSES) oraz California Environmental Protection Agency (Kalifornijską Agencję Ochrony Środowiska).

Modele badawcze

• Mysi model fototrombotycznego udaru mózgu
• Komórkowe modele udaru mózgu oraz choroby Alzheimera
• Prenatalne modele ekspozycji na substancje neurotoksyczne, obejmujące badania efektów intrageneracyjnych oraz transgeneracyjnych
• Hodowle pierwotne mysich komórek nerwowych
• Hodowle ludzkich komórek mikrogleju
• Hodowle ludzkich komórek śródbłonka
• Wykorzystanie modelu bariery krew-mózg złożonej z neuronów, astrocytów i komórek śródbłonka

Stosowane techniki badawcze

Analizy molekularne:

• Analiza ekspresji genów przy użyciu ilościowego PCR (qPCR)
• Wykorzystanie technik mikromacierzowych (microarray) do kompleksowego profilowania transkryptomu
• Profilowanie ekspresji mikroRNA (miRNA)
• ocena poziomu i modyfikacji białek metodami immunochemicznymi, w tym western blot oraz testy ELISA

Analizy epigenetyczne:

• Pomiar globalnej i locus-specyficznej metylacji DNA, w tym metylacji promotorów wybranych genów.
• Oznaczanie aktywności enzymów modyfikujących chromatynę, takich jak: metylotransferazy DNA (DNMT), acetylotransferazy histonowe (HAT), deacetylazy histonowe (HDAC) oraz sirtuiny.
• Analiza metylacji RNA (m6A) oraz procesów sumoilacji białek.
• Przeprowadzanie analiz wzbogacenia (enrichment analyses) w celu identyfikacji i charakterystyki zaburzonych szlaków sygnalizacyjnych oraz mechanizmów regulacji transkrypcyjnej na poziomie molekularnym.
• Funkcjonalna modulacja ekspresji genów poprzez zastosowanie RNA interferencyjnego (siRNA), umożliwiającego wyciszanie ekspresji kluczowych genów.

Badanie integralności i przepuszczalności bariery krew–mózg (BBB):

• Z wykorzystaniem trójkomórkowego modelu in vitro opartego na ko-kulturze ludzkich komórek śródbłonka, astrocytów i neuronów.
• Ocena przepuszczalności dla związków modelowych i oznaczanie współczynnika przenikalności (apparent permeability coefficient) Papp

Badania biochemiczne:

Analiza mechanizmów śmierci komórkowej, w tym:

Apoptozy

• • Ocena aktywności kluczowych kaspaz, w szczególności kaspazy-3, -8 i -9, z wykorzystaniem komercyjnych zestawów fluorometrycznych i luminescencyjnych.
  • Analiza fragmentacji DNA techniką TUNEL
  • Analiza potencjału błony mitochondrialnej
  • Obserwacje morfologicznych cech apoptozy (kondensacja chromatyny, fragmentacja jądra, pęcherzykowanie cytoplazmy) przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej (Hoechst 33342)
  • Oznaczenia ekspresji genów i białek regulatorowych apoptozy

Autofagii

• • Z wykorzystaniem komercyjnych zestawów analitycznych (np. Autophagy Assay Kit, CYTO-ID® Autophagy Detection Kit), umożliwiających ilościową ocenę kluczowych markerów autofagii oraz obrazowanie autofagosomów w żywych komórkach.
  • Oznaczenia ekspresji genów i białek regulatorowych autofagii przy użyciu technik qPCR, western blot oraz immunocytochemii.

Stresu oksydacyjnego

• • Pomiar poziomu reaktywnych form tlenu (ROS)
  • Analiza aktywności enzymów antyoksydacyjnych (SOD, katalaza, GPx), stężenia glutationu (GSH/GSSG).
  • Oznaczenia ekspresji genów i białek regulatorowych stresu oksydacyjnego

Ferroptozy

• • Oznaczanie aktywności GPX4, poziomu żelaza Fe²⁺, lipidowych nadtlenków
  • Analiza ekspresji genów regulatorowych

Nekrozy i nekroptozy

• • Uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH)
  • Oznaczanie poziomu genów i białek RIPK1, RIPK3.

dr hab. Agnieszka Wnuk

Kierownik pracowni

+48 12 6623338

wnuk@if-pan.krakow.pl

pokój 341

Pracownicy pracowni

mgr inż. Andrzej Łach

+48 12 6623337

lach@if-pan.krakow.pl

pokój 341

mgr Wiktoria Płonka

+48 12 6623337

plonkaw@if-pan.krakow.pl

pokój 341